· полиакриламидГелът трябва да се образува чрез акриламиден мономер, изходен материал за полимеризация, катализатор и смес от сол и буфер.
· акриламиди BIS (N, N'-метиленов двоен акриламид) е мономерната форма на гел матрица.
· амониев персулфат стартира процеса на адхезивна полимеризация. Формулата на лепилото изисква 10% разтвор на амониев персулфат, приготвен във вода. Повечето от информацията показва необходимост от активна употреба. 10%-ният разтвор обаче може да се постави при 4℃ в продължение на няколко седмици без значителна загуба на активност. Долейте до 10 ml и изхвърлете, когато лепилото не се агрегира.
Съвет: Процентът наакриламидПри секвениране лепилото и протеиновото лепило не са едно и също нещо. Ако използвате предварително приготвен разтвор на акриламид:BIS, уверете се, че сте взели правилната бутилка.
· ТЕМЕД (N, N, N ', N '- тетраметил етилендиамин) е катализатор, в кафява бутилка, поставена в хладилник. Добавя се непосредствено преди изливане на лепилото.
· полиакриламидна електрофореза. Използваното стъкло при електрофорезата трябва да се измива преди и след всяко използване. След електрофорезата, измийте с мека четка и кърпа в гореща сапунена вода, изплакнете с дестилирана вода и оставете да изсъхне.
· Влагата и прахът могат да причинят кухи полимери. Преди електрофореза почистете стъклената плоча с препарат за почистване на стъкло и я избършете с мека четка. Измийте с дестилирана вода и подсушете добре с хартиена кърпичка. Изплакването със 70% етанол преди избърсване с хартия помага за почистване и ускоряване на сушенето. Добавете последователно проби от акриламид: BIS, вода, буферен разтвор, амониев персулфат, TEMED. Разклатете добре и изсипете веднага.
Не е необходимо полиакриламидът да се дегазира преди полимеризация. (Акриламидът преди се поставяше във вакуум, за да се отстранят мехурчетата, защото кислородът инхибира полимеризацията.)
Хоризонтални накрайници за лепене.
· Поставете лист черна хартия в долната кутия, с черен фон, за да направите отвор за пробата, за да се вижда по-ясно.
· буфер, напълнен с резервоар за лепило, точно върху колоидния слой.
· ако ръбът има светлина, включете осветлението, оставете светлината да свети колоидно. Изтеглете пробата в пипетата.
· използване на автоматично пипетиращо устройство.
· при 10-200 mu може да се използва 1 течно движеща се точка в повечето точки на пробата. За много малки отвори на пробата (по-малки от 10μ1) дългата пипетна глава, използвана за секвениране на лепило, е по-удобна.
· пипетиране, докато сте потопени в пробата, вдишвайки бавно движеща се течност. Пробата може да изглежда лепкава от глицерин, а бързото изпомпване може да изтегли въздушни мехурчета в главата на пипетата.
· След вдишване на пробите, пипетиращата глава ще премести внимателно пипетиращата глава по ръба на тръбата или ще избърше с хартия, за да засмуче течната глава извън капчиците. Внимавайте да не засмучете пробата.
Поставете пробата в отвора за пробата
· пипетиращо устройство, за да се поддържа леко налягане, накарайте пробите леко да се движат с преливната течност.
· Пипетиращата глава, поставена в буфера, малко по-високо от отворите за измерване, поддържа положително налягане. Върхът на пипетата може да се постави в малък отвор.
· бавно и равномерно извадете пробите. Върхът на пипетата се поставя над отвора за пробата и пробата ще потъне в отвора. Оставете пробата да потъне, за да запълни отвора, вместо да я натискате.
· След като последната капка от пробата се счупи върху течната глава, течността ще се премести към втория крак, бавно ще се повдигне и ще излезе от буфера
Как се прави вертикално вземане на проби от лепило?
· вертикални точки на лепене, образувани между две парчета стъкло. При много рядко лепило, главата на пипетата дори не може да се постави между две стъклени плочи. Внимавайте с глицерина! Поставете главата на пипетата върху отвора за пробата и пробата ще потъне в него.
· Преди да вземете пробата, не забравяйте да поставите вертикалния връх на отвора за пробата от полипропиленов ацил гел и да го изплакнете. Измийте неполимеризирания акриламид и водата, която може да се появи на дъното на отвора за пробата. Водата може значително да намали отвора за пробата. Използвайте спринцовка от 25 мл или 50 мл и игла 18-G. Изсипете буфера за електрофореза и внимателно промийте отвора за пробата.
· Може да е трудно да се види отворът за пробата, но в същото време останалото е лесно. Ако има излишни отвори, буферът за пробата може да се тества с бромофенол синьо.
Време на публикуване: 31 март 2023 г.